Badania

Badania przeprowadzone na Pomorskim Uniwerystecie Medycznym w Szczecinie przez prof. Mariolę Marchlewicz, dr Aleksandrę Wilk, Justynę Wojnarowicz Katedra i Klinika Chorób Skórnych i Wenerycznych Zakład Dermatologii Estetycznej Katedra i Zakład Histologii i Embriologii

BIOSTYMULUJĄCE WŁAŚCIWOŚCI PREPARATÓW ZAWIERAJĄCYCH ŚLUZ ŚLIMAKA W REGENERACJI SKÓRY Z CECHAMI FOTOSTARZENIA

WSTĘP

Skóra jest narządem, który pozostaje w ciągłym kontakcie z czynnikami środowiskowymi, mogącymi przyspieszać proces starzenia, a zmiany z nim związane są na skórze szczególnie widoczne. Starzenie się skóry jest zależne od czynników endogennych oraz egzogennych, następujących pod wpływem czynników środowiskowych, w tym przede wszystkim pod wpływem promieniowania ultrafioletowego (fotostarzenie).

O potencjale regenerującym śluzu ślimaka Helix aspersa decyduje jego wpływ na wiele procesów naprawczych i pielęgnacyjnych skóry. Stymuluje on różnicowanie komórek naskórka, jak również przyspiesza migrację keratynocytów (HaCaT - nienowotworogenna, unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów człowieka) i fibroblastów skóry właściwej, z obszarów nieuszkodzonych w kierunku miejsc zmienionych procesem zapalnym. Aplikowanie śluzu ślimaka może ponadto wpływać na immunoekspresję markerów komórkowej proliferacji naskórka m.in. Ki67 oraz PCNA, jak również przyczyniać się do organizacji macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez ekspresję MMP-2.

Przystępując do badań sformułowano hipotezę i postawiono kilka celów, które miały posłużyć jej weryfikacji.

Hipoteza

Preparaty zawierające śluz ślimaka wpływają korzystnie na proces regeneracji skóry z cechami fotostarzenia.

Materiał i metody

Badania zostały przeprowadzone na grupie kobiet w wieku od 42 do 62 lat (51,18±5,18), które zgłosiły się do Zakładu Dermatologii Estetycznej (do roku 2020), a obecnie Samodzielnej Pracowni Dermatologii Estetycznej, na konsultacje dermatologiczno-kosmetyczne. Pacjentki poddano serii 6 zabiegów mezoterapii w obrębie skóry twarzy oraz losowo zakwalifikowano do jednej z grup opartej na poszczególnych metodach: mezotarpia mikroigłowa i mezoterapia bezigłowa z wykorzystaniem preparatów: ampułka, maska, serum z naturalnym śluzem ślimaka (98,2%; Nature Biostimulates, Healthy Skin, Siewierz, Polska). Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie (uchwała nr KB-0012/124/19).

Wykonano następujące analizy:

1/ Badania morfologiczne:

(i) Badania histologiczne

preparaty histologiczne wybarwione : ocena organizacji włókien kolagenowych, elastycznych oraz retikulinowych w warstwach skóry właściwej;

· Hematoksyliną i Eozyną – poglądowa morfologia skóry

· Mallory Trichrome - włókna kolagenowe

· Solami srebra - włókna kolagenowe typu III

· Picro Sirius Red - włókna kolagenowe typu I i III

· Orceiną - włókna elastyczne

(ii) Badania morfometryczne:

· Pomiar grubości naskórka

· Pomiar grubości pęczków włókien kolagenowych

(iii) Badanie immunohistochemiczne immunolokalizacja białka Ki-67 i innych markerów proliferacji komórek

2/ Pomiary aparaturowe

· zawartość melaniny w skórze

· nawilżenie skóry

· pH skóry

· jędrność skóry

· przeznaskórkowa urata wody (TEWL)

WYNIKI

Ocena morfologiczna skóry

(i) Badanie histologiczne

Przed zastosowaniem preparatów ze śluzem ślimaka w warstwie brodawkowatej skóry właściwej widoczne były włókna kolagenowe, które były rzadziej upakowane. Ponadto włókna kolagenowe były cieńsze oraz nieregularnie umieszczone. Najbardziej widoczne zmiany morfologiczne w skórze zaobserwowano u pacjentek po zastosowaniu preparatu zawierającego śluz ślimaka (98,2%; Nature Biostimulates, Healthy Skin, Siewierz, Polska) po zabiegu mezoterapii mikroigłowej widoczne były grubsze włókna kolagenowe, które tworzyły i układały się w cienkie pęczki, w warstwie brodawkowatej skóry właściwej. W warstwie siateczkowatej skóry właściwej widoczne były wyraźnie uformowane, o litej strukturze, pęczki włókien kolagenowych. Zmiany te widoczne były na preparatach wybarwionych H&E oraz Mallory Trichrome.

WYNIKI - BADANIA HISTOLOGICZNE (H&E)

Po serii zabiegów (B) w porównaniu do skóry przed zastosowaniem preparatu ze śluzem ślimaka (A) widoczne były grubsze włókna kolagenowe, które tworzyły i składały się w pęczki zarówno w warstwie brodawkowatej jak i siateczkowatej skóry właściwej

WYNIKI - BADANIA HISTOLOGICZNE (Mallory Trichrome)

Po zastosowaniu zabiegów (B) wykorzystując naturalny śluz ślimaka zarówno w warstwie brodawkowatej jak i siateczkowatej, włókna kolagenowe (wybarwione na intensywanie niebieski kolor) upakowane były w grubsze pęczki w porównaniu do skóry przed zastosowaniem preparatu (A).

 

W skórze po zastosowaniu naturalnego śluzu ślimaka metodą mezoterapii mikroigłowej widocznych było więcej włókien retikulinowych, o charakterystycznej dla nich lokalizacji w warstwie brodawkowej tuż pod naskórkiem, jak i w warstwie siateczkowej skóry właściwej. Włókna retikulinowe wybarwione zostały na kolor czarny, co widoczne było na preparatach wybarwionych solami srebra. Skrawki skóry barwione czerwienią Syriusza analizowano pod mikroskopem polaryzacyjnym. W skórze po przebytych zabiegach, zarówno mezoterapii mikroigłowej, jak i bezigłowej, z zastosowaniem śluzu ślimaka widocznych było więcej włókien kolagenowych typu III. Włókna te były widoczne w kolorze jaskrawozielonym. Włókna elastyczne wybarwiono orceiną. Zaobserwowano więcej włókien elastycznych po zabiegach przeprowadzonych w obu grupach.

WYNIKI - BADANIA HISTOLOGICZNE (Silver)

W skórze po zastosowaniu naturalnego śluzu ślimaka (B) widocznych było więcej włókien retikulinowych, w warstwie brodawkowej oraz w warstwie siateczkowej skóry właściwej. Włókna retikulinowe wybarwione zostały na kolor czarny.

WYNIKI - BADANIA HISTOLOGICZNE (Sirius Red)

Po przebytych zabiegach (B) zauważono więcej włókien kolagenowych typu III (jaskrawo zielone zabarwienie włókien) oraz więcej młodych, niedojrzałych włókien kolagenowych typu I (kolor żółty) w porówaniu do skóry przed zastosowaniem serii zabiegów (A), gdzie zaobserwowano więcej włókien kolagenowych typu I (czerwone zabarwienie).

WYNIKI - BADANIA HISTOLOGICZNE (Orceina)

Wyniki wstępne badań wykazują, że po kuracji śluzem ślimaka (B) zaobserwowano w skórze więcej włókien elastycznych w porównaniu do skóry przed zastosowaniem mezoterapii ze śluzem (A).

 

Badanie morfometryczne

Wykres 1. Analiza statystyczna wyników pomiarów morfometrycznych – grubości naskórka oraz średnicy włókien kolagenowych w przypadku mezoterapii mikroigłowej ze śluzem ślimaka.

 

Wykres 2. Analiza statystyczna wyników pomiarów morfometrycznych – grubości naskórka oraz średnicy włókien kolagenowych w przypadku mezoterapii bezigłowej i śluzu ślimaka.

(iii) Badanie immunohistochemiczne

Wyniki dotyczące metod immunohistochemicznych podano w procentach, jako obszar w którym pozytywnie wybarwione zostały na brązowo jądra komórek w skórze.

Po zastosowaniu preparatu zawierającego śluz ślimaka w połączeniu z serią zabiegów przeprowadzonych w grupie mezoterpia mikroigłowa i śluz ślimaka, 3 miesiące po ich zakończeniu zaobserwowano w naskórku zmniejszenie ekspresji Ki-67 z 8,13% do 3,43% oraz wzrost jego immunoekspresji w skórze właściwej z 1,35% do 2,64%. Zaobserwowano także mniejszą procentową immunosupresję PCNA w obrębie naskórka z 8,71% do 4,31% oraz jego wzrost w obrębie skóry właściwej z 1,33% do 2,43%. Po analizie immunolokalizacji MMP-2 w naskórku zaobserwowano wzrost jej zawartości z 10,56% do 14,37%. Różnice zostały potwierdzone statystycznie w każdej analizowanej grupie, co mogło odzwierciedlać procesy przebudowy macierzy pozakomórkowej, podczas regeneracji uszkodzeń posłonecznych skóry.

Po 3. miesiącach od zakończenia serii zabiegów w grupie mezoterpia bezigłowa i śluz ślimaka, zaobserwowano w naskórku zmniejszenie immunoekspresji Ki-67 z 9,08% do 4,05% oraz wzrost jego ekspresji w skórze właściwej z 1,35% do 1,85% (różnice potwierdzone statystycznie). Zaobserwowano wzrost zawartości PCNA w obrębie naskórka z 9,46% do 9,92% a także w obrębie skóry właściwej z 1,66% do 2,87% (różnica potwierdzona statystycznie). Analiza immunolokalizacji MMP-2 w naskórku wykazała zwiększenie jej zawartości z 7,78% do 10,86%, różnica potwierdzona statystycznie

 

 

 

Aparaturowe pomiary kondycji skóry

W grupie pacjentek po zabiegach mezoterapii mikroigłowej ze śluzem ślimaka najbardziej korzystne wyniki zaobserwowano przy 4. pomiarze, czyli 3 miesiące po zakończeniu serii zabiegów. Dotyczyły one poziomu melaniny, nawilżenia warstwy rogowej naskórka, jędrności skóry i TEWL (transepidermalnej utraty wody). Przy 4. pomiarze, w porównaniu do 1. pomiaru zawartość melaniny spadła o 5,6%, co może świadczyć o zmniejszaniu intensywności przebarwień związanych z przewlekłą ekspozycją na promieniowanie ultrafioletowe; nawilżenie warstwy rogowej naskórka wzrosło o 19,7%, a jędrność skóry wzrosła o 20,2%. Wartość pH pozostała podobna podczas wszystkich pomiarów. Natomiast wartość TEWL uległa obniżeniu o 20,1%, co mogło się przyczynić do wykazanego wzrostu nawilżenia naskórka i świadczyć o poprawie funkcjonowania bariery naskórkowej.

W grupie pacjentek po mezoterapii bezigłowej ze śluzem ślimaka nawilżenie warstwy rogowej naskórka pomiędzy pomiarem 1. a 4. istotnie wzrosło i wynosiło odpowiednio 58,77 oraz 70,4. Zaobserwowano także korzystne zmiany parametrów przy 4. pomiarze poziomu melaniny, jędrności oraz TEWL. Przy 4. pomiarze w porównaniu do 1. pomiaru zawartość melaniny spadła o 12,8%; nawilżenie wzrosło o 19,8%; zaś jędrność skóry wzrosła o 47,2%. Odnotowano także niewielki wzrost pH skóry oraz spadek TEWL o 17,1%.

 

W celu pozyskania odczytu bolec dociskowy przy przyłożeniu sondy indentometru zgodnie z dociskiem sprężyny odkształca skórę, mierząc przemieszczanie się pinu w warstwy skóry. Wraz ze wzrostem jędrności skóry maleje wartość otrzymana podczas pomiaru, gdyż przemieszczanie bolca dociskowego sondy w skórze jest coraz bardziej powierzchowne.

 

 

 

 

Podsumowanie i wnioski

Uzyskane wyniki badań sugerują, że w tym układzie doświadczenia, stosowanie preparatów zawierających naturalny śluz ślimaka do pielęgnacji skóry korzystnie wpływało na jej kondycję. Zaobserwowano bowiem zmiany morfologiczne, wskazujące na poprawę kondycji skóry, obejmujące poprawę architektury naskórka, organizacji włókien kolagenowych, elastycznych, retikulinowych, co dodatkowo zostało potwierdzone badaniami immunohistochemicznymi. Ponadto zauważono poprawę parametrów morfometrycznych w skórze, normalizację grubości naskórka oraz pogrubienie pęczków włókien kolagenowych w tkance łącznej skóry właściwej.

Aparaturowe pomiary kondycji skóry wykazały korzystny wpływ stosowania preparatów zawierających śluz ślimaka, szczególnie oceniane po 3 miesiącach od zakończenia serii zabiegów, na obniżenie poziomu melaniny w skórze (redukcja przebarwień), obniżenie wartości TEWL (poprawa funkcjonowania bariery naskórkowej), poprawę nawilżenia warstwy rogowej naskórka, zwiększenie jędrności skóry.

Porównując metody aplikowania śluzu ślimaka, zarówno mezoterapia mikroigłowa, jak i bezigłowa, poprawiają badane parametry skóry świadczące o jej kondycji (wzrost nawilżenia skóry, poprawę jej wygładzenia oraz rozświetlenia, zredukowania przebarwień, spłycenia zmarszczek) co również zaobserwowały pacjentki w subiektywnym odczuciu oceniając bardzo pozytywnie w ponad 90 %.

Dodatkowo, należy podkreślić fakt, że u żadnej pacjentki nie wystąpiły jakiekolwiek skutki uboczne, jak reakcje alergiczne, zaczerwienienia skóry, wysypka, przebarwienia, bądź inne.

Uzyskane wyniki badań, w tym układzie doświadczenia wykazały, że preparaty zawierające śluz ślimaka mogą być uważane za biostymulatory tkankowe.

 

 

BADANIA DOTYCZĄCE AKTYWNOŚCI PRZECIWDROBNOUSTROJOWEJ SERUM ŻEL Z NATURALNYM ŚLUZEM ŚLIMAKA I KWASEM HIALURONOWYM

Kierunki podjętych analiz

Analizę właściwości przeciwdrobnoustrojowych wykonano z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody mikrorozcieńczeń w bulionie Miller-Hinton. Do analiz wykorzystano dwa referencyjne szczepy gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) o numerach ATCC25923 oraz ATCC43300.

Opis uzyskanych wyników

Zaobserwowano aktywność przeciwdrobnoustrojową dostarczonego materiału badawczego  na wykorzystanych szczepach Staphylococcus aureus. Aktywność była zachowana przy stężeniach wyższych niż 25% (obj./obj.) zawartości serum w przygotowanych próbach.

Opis wyników w świetle dostępnej literatury

Aktywność przeciwbakteryjną śluzu ślimaka oceniano po raz pierwszy na próbce afrykańskiego ślimaka olbrzymiego Achatina fulica. W pracy zbadano dwie różne frakcje śluzu ślimaka: frakcję rozpuszczalną w wodzie oraz frakcję mucynową zawierającą białka. Obie frakcje wykazały pozytywne działanie przeciwbakteryjne wobec bakterii Gram-dodatnich, takich jak Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus, oraz szczepów Gram-ujemnych, takich jak Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa. Ponadto frakcja mucyny okazała się skuteczniejsza wobec bakterii w porównaniu z frakcją rozpuszczalną w wodzie. Śluz ślimaka może wykazywać właściwości przeciwdrobnoustrojowe dzięki peptydom przeciwdrobnoustrojowym, które były z niego izolowane już wcześniej np. Achacyna, Achatyna CRP (białko C-reaktywne), Mytimacin-AF czy Hemocyanina β. Achacyna ze śluzu afrykańskiego ślimaka olbrzymiego hamowała wzrost Escherichia coli i Staphylococcus aureus. Białko C-reaktywne Achatyna ze śluzu Achatina fulica wykazywało skuteczne działanie przeciwbakteryjne przeciwko Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus epidermidis Dwa nieznane i niezdefiniowane związki wyizolowane metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) ze śluzu Achatina fulica wykazały zahamowanie wzrostu Escherichia coli i Vibrio cholerae. Staphylococcus aureus stanowił najbardziej wrażliwy szczep bakterii podlegający działaniu przeciwbakteryjnemu Mytimacin-AF, białka ze śluzu ślimaka afrykańskiego. Z dostępnej literatury i wyników przeprowadonych badań wynika że śluz ślimaków oraz jego pochodne składniki, takie jak achacyna, achatyna CRP i mytimacyna-AF, wykazywały wysoką aktywność przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym.

Literatura
1. Pitt, S.J.; Graham, M.A.; Dedi, C.G.; Taylor-Harris, P.M.; Gunn, A. Antimicrobial properties of mucus from the brown garden snail Helix aspersa. Br. J. Biomed. Sci. 2015, 72, 174–181.
2. Iguchi, S.M.M.; Aikawa, T.; Matsumoto, J.J. Antibacterial activity of snail mucus mucin. Comp. Biochem. Physiol. -- Part A Physiol. 1982, 72, 571–574.

3. Cilia, G.; Fratini, F. Antimicrobial properties of terrestrial snail and slug mucus. J. Complement. Integr. Med. 2018, 15

 

 

Wszystkie badania (dermatologiczne, aplikacyjne, aparaturowe) preparatu Healthy Skin Serum żel z naturalnym śluzem ślimaka i kwasem hialuronowym prowadzono pod nadzorem lekarzy specjalistów dermatologów w akredytowanej, certyfikowanej, działającej zgodnie z Deklaracją Helsińską Klinice Dermatologii.

WNIOSKI Z BADAŃ PRZEPROWADZONYCH W KLINICE DERMATOLOGII W 2015 R.: 

• Badania aparaturowe oraz probanci potwierdzili, iż „Healthy Skin – Serum żel z naturalnym śluzem ślimaka i kwasem hialuronowym” dzięki dobrze skomponowanym aktywnym składnikom zawartym w produkcie wykazuje bardzo korzystne, wielokierunkowe działanie.
  
  
• W opinii probantów i lekarzy nadzorujących badanie, kompozycja użytych składników w ocenianym preparacie intensywnie pielęgnuje i regeneruje skórę.
  
  
• Pomiary TEWL wykazały, że „Healthy Skin – Serum żel z naturalnym śluzem ślimaka i kwasem hialuronowym”, poprawia i utrzymuje stabilny, głęboki poziom nawilżenia skóry, poprzez spowalnianie odparowania wody własnej z naskórka.
  
  
• Ochronny płaszcz pozostający na skórze po zastosowaniu preparatu, spowalnia naturalną ucieczkę endogennej wody, która w wyniku działania niekorzystnych (wysuszających) czynników zewnętrznych, szybciej niż zazwyczaj, odparowuje z warstwy rogowej naskórka.
  
  
• Skóra po zastosowaniu „Healthy Skin – Serum żel z naturalnym śluzem ślimaka i kwasem hialuronowym”, zostaje okryta płaszczem ochronnym, który skutecznie, jeszcze nawet 2h po aplikacji, zmniejsza szybkość odparowania wody własnej z warstwy rogowej naskórka, dając możliwość utrzymania fizjologicznego głębokiego nawilżenia skóry.
  
  
• Po zastosowaniu preparatu nie zachodzi jednak zjawisko okluzji ciągłej, które ma bardzo niekorzystny wpływ, zarówno na gospodarkę hydro – lipidową skóry, jak i na wymianę gazową (tzw. oddychanie skórne).
  
  

• Dzięki przywróceniu fizjologicznego płaszcza hydrolipidowego podrażniona lub zmieniona chorobowo skóra staje się doskonale wypielęgnowana.

• Zaobserwowano, iż dzięki odpowiedniemu nawilżeniu, działaniu kojąco – regenerującemu, żel likwiduje nieprzyjemne uczucie napięcia, świądu czy pieczenia towarzyszące stanom zapalnym.

• Odnotowano ponadto, iż żel jest bardzo praktyczny w użyciu, dobrze się rozprowadza na skórze pozostawiając delikatny, aksamitny film.

• Prowadzone badania wykazały, iż dobra kombinacja bezpiecznych, aktywnych składników przynosi ulgę w schorzeniach z objawami świądu, łuszczenia oraz łojotoku.

• Probanci z różnego rodzaju dermatozami oraz lekarze prowadzący ocenę żelu zaobserwowali szybsze ustępowanie objawów chorobowych.

• W trakcie oceny zaobserwowano, iż preparat przyczynia się do poprawy nawilżenia skóry, co spowodowało ograniczenie łuszczenia się skóry, a także dzięki właściwościom kojącym zmniejszenie jej zaczerwienienia.

• Osoby uczestniczące w badaniu ze zmianami o charakterze egzemy i atopowego zapalenia skóry stwierdziły, iż żel wykazuje działanie przeciwzapalne i przeciwświądowe przez co ogranicza możliwość rozwoju infekcji oraz przyspiesza ustępowanie zmian skórnych.

• Szybko i skutecznie łagodzi podrażnienia, likwiduje objawy szorstkości, łuszczenia oraz towarzyszące tym objawom odczucia subiektywne w postaci napięcia i pieczenia skóry.

• „Healthy Skin – Serum żel z naturalnym śluzem ślimaka i kwasem hialuronowym” dzięki dobrze dobranym składnikom aktywnym daje poczucie właściwego nawilżenia, nie powodując uczucia dyskomfortu spowodowanego nadmiernym „błyszczeniem” lub „świeceniem” skóry.
• Regularne stosowanie żelu wpływa korzystnie na ustępowanie istniejących zmian dermatologicznych i współistniejących dolegliwości, sukcesywnie poprawiając kondycję i wygląd skóry.

Nr badań: B - 0088/15